HC6. Repair

Algemene informatie

• Welke onderwerpen worden behandeld in het hoorcollege?
  • In dit college worden verschillende wijzen waarop mutaties ontstaan en manieren waarop DNA hersteld wordt besproken
• Welke onderwerpen worden besproken die niet worden behandeld in de literatuur?
  • Alle onderwerpen in dit college worden ook behandeld in de literatuur
• Welke recente ontwikkelingen in het vakgebied worden besproken?
  • Er worden geen recente ontwikkelingen besproken
• Welke opmerkingen worden er tijdens het college gedaan door de docent met betrekking tot het tentamen?
  • Er zijn geen opmerkingen met betrekking tot het tentamen gedaan
• Welke vragen worden behandeld die gesteld kunnen worden op het tentamen?
  • Er zijn geen mogelijke vragen behandeld

Consequenties van mutaties

Het lichaam bestaat uit 10¹⁴ cellen. Elke cel heeft 6 x 10⁹ baseparen. Gedurende het leven vindt er een turnover plaats van 100x het lichaam, dus 10¹⁶ cellen.

Het proces van celdeling duurt ongeveer 5 uur. Hierbij worden de 6 x 10⁹ baseparen bijna foutloos gekopieerd: er treedt minder dan één fout per celdeling op.

Een mutatie is een permanente verandering in de DNA-sequentie die wordt doorgegeven aan dochtercellen of aan het nageslacht. Mutaties ontstaan tijdens normale cellulaire processen of door blootstelling aan chemicaliën gedurende het leven. Er zijn 3 soorten mutaties:

• Genoommutatie: winst of verlies van chromosomen
  • Verandering van het karyotype
  • Genoommutaties zijn vaak aanwezig in kankercellen
• Chromosoommutatie: verandering binnen een chromosoom
  • Translocatie of inversie
• Genmutatie: verandering binnen een gen
  • Basepaarsubstitutie, insertie of deletie
    • Sikkelcelanemie wordt veroorzaakt door een basepaarsubstitutie in B-globine, met een afwijkende bouw van de rode bloedcellen als gevolg
      • A-T is gemuteerd tot T-A

Mutaties in coderende sequenties:

• Stille mutatie: heeft geen invloed op de aminozuurvolgorde van het polypeptide waar het gen voor codeert
• Missende mutatie: zorgt ervoor dat het triplet codeert voor een ander aminozuur
  • Als het gesubstitueerde aminozuur geen detecteerbaar effect heeft op de eiwitfunctie kan deze mutatie neutraal zijn
• Nonsense mutatie: verandering van een normaal codon in een stopcodon
  • Heeft vaak een functieverandering als gevolg
• Frameshift mutatie: insertie of deletie die ervoor zorgt dat het leesraam verandert
  • Translatie van het nieuwe mRNA resulteert vanaf de plaats van de mutatie in een verschillende aminozuursequentie
  • Omdat 3 van de 64 codons een stopcodon zijn, treedt vaak al snel na de mutatie terminatie van de translatie op

Mutaties in niet-coderende sequenties:

Ook in niet-coderende sequenties kunnen mutaties optreden (maar 3% van ons genoom is gecodeerd):

• Mutatie van een promotor: laat de mate van transcriptie toe- of afnemen
  • Bij het syndroom fragile X is er een repeterende regio aanwezig tussen de promotor en het open reading frame van het FMR1-gen → deze regio kan uitbreiden → leidt tot silencing: het gen komt niet meer tot expressie
• Mutatie van een regulatoir element: verstoort de regulatie van genen
• Mutatie van 5’UTR of 3’UTR: verandert de mRNA-stabiliteit of beïnvloedt de mRNA translatie
  • UTR staat voor untranslated regions (de sequenties die voor en achter het open reading frame liggen)
• Mutatie van een splice-herkenningssequentie: verstoort de correcte splicing
  • AGG is een voorbeeld van een splice-herkenningssequentie

Germline versus somatische mutaties:

• Germline mutatie: de mutatie manifesteert in alle cellen van het nageslacht
  • De ouders zijn drager van de mutatie of de mutatie is opgetreden in de gameten
  • De meeste overerfbare ziektes zijn gevolgen van germline mutaties
• Somatische mutatie: de mutatie manifesteert alleen in de dochtercellen van een gemuteerde cel
  • Treedt op bij DNA-replicatie tijdens de ontwikkeling
  • Een gevolg van somatische mutaties is kanker

Het ontstaan van DNA-schade en mutaties

Er is een verschil tussen DNA-fouten en mutaties:

• DNA-fouten geven een verstoring van de dubbele helix → zijn herkenbaar voor een enzymcomplex → cel kan hier nog op reageren
• Mutaties zijn voor de cel niet herkenbaar → worden niet hersteld

Het kost een mismatch van twee basen twee replicatierondes voordat de fout is gefixeerd in het genoom en is veranderd in een mutatie.

Mutaties ontstaan tijdens de DNA-replicatie:

• Door DNA-replicatiefouten
  • DNA-polymerase maakt 1 fout per 10⁵ incorporaties → per celdeling zijn er 60.000 fouten
  • Door proofreading (exonuclease-activiteit) van DNA-polymerase vermindert het aantal fouten
    • Het aantal fouten is nu 1 op 10⁷
      • Mutaties die de proofreading domeinen van polymerase delta en epsilon aantasten vergroten de kans op darmkanker
      • De activiteit van polymerase inclusief exonuclease levert per celdeling 600 fouten op
  • Mismatch herstel: reduceert het aantal fouten van 1 op 10⁷naar 1 op 10⁹ of 10¹⁰
    • Mismatch-repair eiwitten verwijderen het nieuw gesynthetiseerde DNA tot aan het foute basepaar, waar vanuit de keten opnieuw wordt opgebouwd
    • Mutaties in MLH1, MSH2 of PMS2 vergroten de kans op Lynch-syndroom
      • Hierbij is er een mismatch herstel deficiëntie, waardoor er een predispositie voor darmkanker is
    • De activiteit van polymerase inclusief exonuclease inclusief mismatch herstel levert minder dan 1 fout per celdeling op
• Door replicatie van beschadigd DNA (door translaesie synthese polymerases)
  • Translaesie synthese polymerases zijn enzymen die specifiek het beschadigde DNA repliceren → kunnen dan wel een nucleotide inbouwen (niet altijd foutloos)
    • Er zijn minimaal 15 verschillende DNA-polymerases, waarvan 6 specifiek beschadigd DNA repliceren
      • Deze zijn minder nauwkeurig dan het normale DNA-polymerase, maar zorgen er wel voor dat de replicatie wordt voortgezet
  • Hierbij kan replicatie van verschillende beschadigingen optreden:
    • Omgeving-geïnduceerde DNA-schade
      • Bv. door UV-straling
    • Beschadigd DNA door endogene bronnen
      • Bv. door vrije radicalen → komen vrij bij een normaal celmetabolisme
    • Beschadigd DNA door chemische instabiliteit: verlies van 10.000 basen per cel per dag
      • Bv. door spontane mutaties zoals depurinering en deaminering

DNA-beschadigende factoren:

Er zijn verschillende DNA-beschadigende factoren:

• Leefstijl (blootstelling aan UV, roken, alcohol, etc.)
• Omgeving (industriële vervuiling)
• Medische behandelingen (röntgenfoto’s, CT-scans, chemotherapie)
• Voedsel (chemicaliën)

UV-straling:

UV-straling kan leiden tot een covalente binding tussen twee naast elkaar gelegen basen → het DNA-polymerase blokkeert en er wordt een translaesie synthese polymerase (TLS) naar de afwijkende base getransporteerd om daar een nucleotide in te bouwen: 

• Soms herkent TLS de afwijkende base en kan de juiste base worden ingebouwd.
• Soms gebeurt dit niet en wordt een verkeerde base ingebouwd
  • Een verkeerd ingebouwde nucleotide heeft minder ernstige gevolgen dan DNA dat vanaf de afwijkende base niet gerepliceerd wordt
  • DNA-polymerase ŋis specifiek voor de replicatie van DNA-schade door UV-straling

Xeroderma Pigmentosum:

Xeroderma Pigmentosum is een syndroom waarbij sprake is van een deficiëntie van de Pol η translaesie synthese of van de nucleotide-excisieherstel. Gevolgen zijn pigmentatie van de huid en een verhoogde kans op tumoren bij veelvuldige blootstelling aan zonlicht.

Chemische instabiliteit:

DNA zelf is niet stabiel. Er zijn twee vormen van chemische instabiliteit:

• Depurinering
  • De base wordt door opname van water losgekoppeld van het nucleotide
    • Depurinering creëert apurinische plaatsen (AP-sites) → plaatsen in het DNA waar geen base voorkomt
      • Per dag worden 20.000 AP-sites gevormd → de coderende capaciteit van het genoom vermindert
• Deaminering
  • In cytosine komt op de plaats van de dubbel gebonden NH2-groep (amine) een dubbel gebonden O-atoom → het molecuul verandert in uracil → gaat baseparen met adenine
    • Door het O-atoom kan er een tweede waterstofbrug worden gevormd
    • Deanimering creëert dus een U-A baseparing
  • Vindt ongeveer 100x per genoom per dag plaats → verandert de coderende capaciteit van het genoom

Het is belangrijk de schade te repareren voordat het DNA wordt gerepliceerd → tijdens de replicatie vindt fixatie plaats.

Exogene bronnen:

Er zijn verschillende exogene bronnen die kunnen leiden tot DNA-schade:

• Basemodificaties
  • Ontstaan bv. door vrije radicalen of sigarettenrook
  • Worden hersteld door base-excisieherstel (BER)
• Bulky DNA damage
  • Ontstaan bv. door UV-straling
  • Wordt hersteld door nucleotide-excisieherstel (NER)
• Dubbelstrengse breuken
  • Ontstaan door ioniserende straling
  • Worden hersteld door dubbelstrengs-breukherstel
    • Non-homologous end joining (NHEJ)
    • Homologe recombinatie (HR)

Overzicht:

Een overzicht van hoe mutaties kunnen ontstaan:

• Replicatiefouten
  • Mismatches: inserties/deleties
• Hydrolysereacties
  • Depurinering: AP-plaats
  • Deaminering: baseparing met uracil
• UV-licht
  • Helix-verstorende laesies
• Reactieve metabolieten
  • Baseschade
• Straling → replicatievork collapse
  • Dubbelstrengse breuk

Herstelmechanismen voor DNA-schade

Er zijn verschillende mechanismen die DNA-schade kunnen herstellen.

Base-excisieherstel (BER):

Dubbelstrengs DNA is een duplex van twee complementaire moleculen → het draagt twee kopieën van de genetische informatie. Bij een basemodificatie is de informatie die in één streng beschadigd is, wel aanwezig in de andere streng.

Zo kan uracil-DNA-glycosylase een uracil-base uit het DNA verwijderen, waardoor de andere streng als template wordt gebruikt om een nucleotide opnieuw te incorporeren:

1. Epi-endonuclease koppelt het resterende suikerfosfaat los → wordt verwijderd uit de backbone
2. Een nieuw nucleotide met een base die complementair is met de base op de nog intacte DNA-streng wordt door DNA-polymerase ingebouwd
   • Dit kan door ligase-activiteit: koppelt een nieuwe nucleotide aan het 5’-uiteinde van de nucleotide die al is ingebouwd

Nucleotide-excisieherstel:

Nucleotide-excisieherstel is gebaseerd op hetzelfde principe als BER: de beschadigde nucleotide wordt verwijderd en de nog intacte DNA-streng wordt gebruikt als templatestreng. Hierbij zijn enzymen betrokken:

• Er zijn verschillende enzymen die specifiek zijn voor een bepaalde beschadiging
  • Deze enzymen herkennen niet de afwijking zelf, maar de verstoring in de helix

Nucleotide-excisieherstel (en BER) zorgt ervoor dat tijdens de DNA-replicatie er geen DNA-schade meer aanwezig is → er treden geen mutaties op.

• Nucleotide-excisieherstel deficiëntie leidt tot Xeroderma Pigmentosum

Non-homologous end joining (NHEJ):

Bij non-homologous end joining worden de gebroken chromosomen na een kleine bewerking van de uiteinden aan elkaar geplakt. Dit wordt gedaan door enzymen. Het mechanisme vindt plaats als de suikerfosfaat backbone is gebroken.

• NHEJ heeft mutaties (vaak deletie) als gevolg
• Klinische manifestatie van foutieve NHEJ zorgt voor stralingsgevoeligheid en immuundeficiëntie

Homologe recombinatie (HR):

Homologe recombinatie kan alleen optreden als het DNA pas net gerepliceerd is → alleen dan is er een kopie van het chromosoom aanwezig. Homologe recombinatie:

• Herstelt een dubbelstrengse breuk door het gebruik van zusterchromatiden of homologe chromosomen
  1. De uiteinden worden bewerkt → krijgen een 3’-staart
  2. Eén 3’-staart bindt aan het zusterchromatide → wordt verder gesynthetiseerd totdat het weer alle informatie bevat
  3. De andere 3’-staart bindt aan het nieuw gesynthetiseerde deel van de ene streng
  4. Het gat dat zich in de andere streng bevindt wordt opgevuld
• Heeft geen mutaties tot gevolg
  • In het proces kunnen wel mutaties plaatsvinden: leiden tot borst- en eierstokkanker
    • Bij de borstkankergenen (BRCA1 en BRCA2) worden de breuken niet foutloos hersteld → mutaties → kanker
      • Allelfrequentie: 1/1000

Overzicht