HC2. Genoomorganisatie

Algemene informatie

• Welke onderwerpen worden behandeld in het hoorcollege?
  • In dit college wordt de globale indeling van het genoom besproken
• Welke onderwerpen worden besproken die niet worden behandeld in de literatuur?
  • Alle onderwerpen in dit college worden ook behandeld in de literatuur
• Welke recente ontwikkelingen in het vakgebied worden besproken?
  • Verschillende manieren chromosomen af te beelden
• Welke opmerkingen worden er tijdens het college gedaan door de docent met betrekking tot het tentamen?
  • Er zijn geen opmerkingen gemaakt over het tentamen
• Welke vragen worden behandeld die gesteld kunnen worden op het tentamen?
  • Er zijn geen potentiële tentamenvragen besproken

Opbouw van een dubbele helix

Nucleotiden (desoxyadenosinemonofosfaat) zijn de bouwstenen van DNA. Het centrum van een nucleotide bestaat uit een suikergroep. Deze suikergroep heeft genummerde C-atomen met daaraan verschillende groepen:

• Op 1’ (C-atoom 1) zit een base
• Op 3’ (C-atoom 3) zit een OH-groep
• Op 5’ (C-atoom 5) zit een fosfaatgroep 
  • Deze is negatief geladen → zorgt voor polariteit

Een DNA-streng ontstaat doordat meerdere nucleotiden aan elkaar worden gekoppeld:

• De ruggengraat van een DNA-molecuul heet de “suikerfosfaatbone”
• De twee DNA-strengen lopen antiparallel aan elkaar: de 5’ kant van het ene molecuul zit aan dezelfde zijde als de 3’ kant van het andere molecuul
• DNA-strengen komen samen in een dubbele helix → deze bestaat dus uit twee polynucleotideketens:

• Deze ketens worden via de bases met elkaar verbonden. Er ontstaan verbindingen tussen tegenoverliggende bases door waterstofbruggen:
  1. 1. Adenine (A) vormt een paar met thymine (T)
        • Hierbij zijn 2 H-bruggen betrokken → minder stevig
     2. Guanine (G) vormt een paar met cytosine (C)
        • Hierbij zijn 3 H-bruggen betrokken → stevig
• Adenine en guanine zijn purines (2 ringen)
• Thymine en cytosine zijn pyrimidines (1 ring)

Hiermee wordt de basis voor het overervingsmechanisme gevormd.

Semi-conservatieve replicatie

Bij DNA-replicatie wordt het DNA gekopieerd. De template streng is de streng die wordt gekopieerd. Bij DNA-replicatie wordt van elke streng (polynucleotideketen) één kopie gemaakt. De kopie van de ene streng wordt vervolgens verbonden aan de oude versie van de andere streng, en vice versa. Er is dus in beide kopieën één oude en één nieuwe streng aanwezig. Hierdoor blijft generatie op generatie het DNA correct.

Feitjes humane genoom

Het humane genoom is de complete genetische samenstelling van een mens:

• Het humane genoom bestaat uit 3 miljard baseparen
• Er zijn 22000 eiwit-coderende genen
  • Heel veel genen coderen niet voor een eiwit, maar voor een RNA
• De lengte van het humane genoom is 1 meter (Watson-Crick dsDNA)
  • Dus er is 2 meter in een kern, want deze bestaat uit 2 sets chromosomen
• De diameter van DNA is 2 nanometer
• Het gewicht is 3 picogram (pg)
• Er zijn 46 chromosomen
  • 23 (24)
    • 22 autosomen
    • 2 gonadosomen of sekschromosomen
• Er is één kopie van het genoom in de kern van een sperma of eicel → haploïd
• Er zijn twee kopieën in het fusieproduct (zygote) → diploïd
• Er zijn twee kopieën in een somatische celkern
• Diameter van een typische kern: 6-8 micrometer
• Genomisch DNA is verpakt in eiwitten: chromatine
  • Een complex van histonen (discusvormige eiwitten) met DNA eromheen 
    • Heterochromatine: gecondenseerd, transcriptioneel inactief chromatine
      • Kan weinig RNA en dus weinig eiwitten maken
    • Euchromatine: gedecondenseerd, transcriptioneel actief chromatine
      • Kan veel DNA en dus veel eiwitten maken

Chromosoom nomenclatuur

Een chromosoom bestaat uit een centromeer met daarop de P-arm (korte arm) en de Q-arm (lange arm). Deze “armen” zijn chromatiden. De uiteindes van deze armen heten telomeren. Op basis hiervan worden chromosomen op verschillende manieren geclassificeerd:

• Metacentrisch
  • P en Q-arm hebben vrijwel dezelfde lengte
  • Zijn te herkennen aan de bandering
• Submetacentrisch
  • De P-arm is een stuk korter
• Acrocentrisch
  • De P-armen zijn zo kort dat het satellieten worden genoemd → hierop liggen genen die coderen voor rRNA

Deze classificatie wordt gedaan op basis van:

• Lengte
• Positie van het centromeer → definieert de korte (P) en de lange (Q) armen

Niet alle chromosomen kunnen hiermee uniek geïdentificeerd worden, omdat er in de lengte heel weinig verschil kan zitten.

Sequentie organisatie

De sequentie organisatie beschrijft de volgorde van alle A’s, T’s, C’s en G’s in een sequentie: 

• Bijna alle genen hebben een unieke DNA-sequentie, die maar één keer voorkomt in ons genoom → dit zijn single-copy genen.
  • De ribosomale RNA (rRNA) genen vormen hierop een uitzondering:

• Er zijn honderden rRNA genen per genoom
• rRNA genen liggen op de satellieten van de 5 acrocentrische chromosomen

• Repetitieve sequenties
  • Liggen gegroepeerd in repeterende stukken, bijvoorbeeld bij centromeren
  • In niet-coderende stukken DNA (junk DNA) kan ook belangrijke informatie liggen!

DNA-folding

Vanwege de aanwezigheid van fosfaatgroepen is DNA negatief geladen. Echter zijn histoneiwitten rijk aan positief geladen aminozuren → DNA en de histoneiwitten trekken elkaar aan → vormen samen chromatine, een complex van DNA en eiwitten in de kern:

1. Het DNA windt zich om een complex van 8 (2x4) histoneiwitten en vormt zo een nucleosoom
   • De 2 nm fase
2. Het vormt zo een ketting (beads-on-a string)
   • De 11 nm fase
3. Deze wordt verder gecondenseerd door een 5^ehistoneiwit → schuift alles dichter tegen elkaar aan
   • De 30 nm fase
4. De fiber gaat lussen vormen → condenseren verder → vormen interfase chromosomen
   • De 700 nm fase
   • DNA bevindt zich in een normale niet-delende cel in de 700 fase → er moet continu RNA gemaakt kunnen worden om eiwitten te produceren
5. Mitotische chromosomen ondergaan een nog verdere vorm van condensatie/verpakking
   • De 1400 nm fase
   • Metafase chromosomen zijn de meest gecondenseerde vorm van chromatine
     • Tijdens de metafase vindt geen transcriptie plaats
       • Transcriptie is het afschrijven van DNA in RNA
       • Als de metafase wordt afgebeeld zijn 2 chromatiden van een net gedeelde RNA te zien

Identificatie van chromosomen

Karyotypering:

G-bandering zorgt voor eenduidige chromosoomidentificatie → karyotypering:

1. Metafase preparaten worden gekleurd → Giemsa kleuring
   • Chromosomen moeten levend zijn
   • Cellen worden osmotisch opgezwollen, op een glaasje uitgespreid en gekleurd
2. Er ontstaat een patroon van donker en lichter gekleurde banden
   • Dit is een soort unieke barcode
   • Cytogenetici hebben lang geleden alle “barcodes” voor elk chromosoom op deze manier gekarakteriseerd
3. Er ontstaat een lage resolutie kaart van het genoom
   • Er worden maximaal 850 banden afgebeeld
   • Er zijn ongeveer 3 miljoen baseparen per band
   • Vooral gebaseerd op AT of GC rijke gebieden
4. In ideale vorm kan er een idiogram gemaakt worden: een schematisch weergave van de chromosomen

FISH-screening:

De opvolger van karyotypering is DNA-sequentiedetectie d.m.v. fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). Te onderzoeken DNA wordt gekleurd met FISH-stoffen:

• Dit gebeurt in meta- of interfase cellen
  • In de metafase wordt translocatie aangetoond
  • In de interfase wordt trisomie 21 aangetoond
• Specifieke stukken DNA in de cel worden aangekleurd met fluorescente probes
  • Resolutie: ongeveer 100.000 baseparen
• Wordt gebruikt bij detectie van gendeletie
• Elk mogelijk chromosoom wordt aangekleurd met een ander kleurtje → whole genome paint

FISH-screening gebeurt als volgt:

1. dsDNA (double stranded DNA) wordt gedenatureerd in fixed cells → er ontstaat single stranded DNA
2. Single stranded DNA wordt “geïncubeerd” met DNA probe
3. Probe DNA wordt gelabeld met fluorescente kleuring
4. Probe DNA wordt gedenatureerd
5. Target DNA ritst open → wordt gehybridiseerd met probe DNA
   • Target DNA wil het liefst met zichzelf hybridiseren en weer dubbelstrengs worden
   • Door heel veel probe DNA toe te voegen zal het met target DNA hybridiseren
6. De moleculen worden met een fluorescentiemiscroscoop gewassen

Hierdoor wordt DNA zichtbaar gemaakt.

Comparative Genome Hybridization (CGH): 

• Losses en gains van DNA over het hele genoom worden gedetecteerd
• Referentie DNA wordt vergeleken met test DNA
  • Referentie DNA wordt rood gelabeld
  • Test DNA wordt groen gelabeld
• Gebeurt via Array-CGH of SNP-array

1. Er wordt gehybridiseerd op een glazen plaat waar DNA is uitgesmeerd in spotjes
2. Bij hybridisatie blijft het plakken op de spotjes
3. De plaat wordt gescand
   • Geel: evenveel DNA
   • Rood: minder DNA → monosomie
   • Groen: meer DNA → trisomie

Next generation sequencing:

Door verschillende laboratoriumtechnieken is het mogelijk om tot op 1 basepaar nauwkeurig te kijken hoe het DNA in elkaar zit. Zo kan precies ontdekt worden wat de oorzaak is.