Bevat week 6 van de collegeaantekeningen van 2014-2015

Hoorcollege Lysosomen (1-12-14)

Het milieu op aarde is bedreigend voor koolwaterstofverbindingen. Deze verbindingen lopen constant de kans geoxideerd te worden door zuurstof of radicalen.

Door het permanent verversen van celonderdelen, kunnen cellen in de mens lang bestaan. Er vindt dus herstel van schade plaats. Bij bijvoorbeeld bacteriën vindt geen herstel van schade plaats. Door veel celdelingen kunnen deze organismen toch blijven voortbestaan. De afgebroken delen van cellen van meercellige organismen worden, zo mogelijk, hergebruikt. Afbraak van macromoleculen vindt plaats in afgesloten ruimtes; de lysosomen. Deze organellen, omgeven door een membraan, zijn zuur (dus lage pH) van binnen en bevatten hydrolasen. In een enkele cel zitten zo’n 100 lysosomen, welke in totaal 5-10% van het celvolume in beslag nemen.

Via endocytose komen losse moleculen/partikels naar binnen. Deze worden ingesnoerd en uiteindelijk omringd door een blaasje. Dit blaasje met moleculen noemt men dan een endosoom. Het endosoom versmelt met een primaire lysosoom en er ontstaat een secundaire lysosoom, waarin de moleculen worden afgebroken. Afbraak van bacteriën gaat via fagocytose. Een bacterie wordt dan ‘gevangen’ in een blaasje en komt zo de cel in. Dit blaasje heet dan een fagosoom. Het fagosoom versmelt met een lysosoom en de bacterie wordt afgebroken. Bij autofagie wordt een deel van de cel omgeven door het membraan (dubbelmembraan). Er is dan een autofagosoom ontstaan, wat ook versmelt met een lysosoom. Delen van de cel worden zo afgebroken, wat ervoor zorgt dat de cel zichzelf kan blijven vernieuwen. Ook is er micro-autofagie. Dit is hetzelfde proces voor kleinere onderdelen. Materiaal vanuit binnen de cel gaat dus via autofagosomen en extracellulaire onderdelen gaan via endocytose. Beide fuseren daarna met al bestaande lysosomen.

Deze processen worden geruguleerd door specifieke transcriptie factoren en door mTOR. Dit werkt als volgt: er is verminderde nutrient release. Dit zorgt voor inactivering van mTOR. Vervolgens gaan transcriptiefactoren (o.a. TFEB) naar de celkern, waarna de aanmaak van lyosomen en autofagosomen verhoogd.

Het binnenste van een lysosoom heeft een pH van tussen de 4.5 en de 5.2. Er zit honderd keer meer H+ in het lysosoom dan erbuiten. Dit evenwicht wordt d.m.v. een proton-pomp in stand gehouden. Deze proton-pomp is een V-type ATP-ase, en verbruikt dus ATP.

Er zitten veel verschillende enzymen in een lysosoom die elk een ander groot molecuul kunnen splitsen tot losse eenheden. Dit zijn gespecialiseerde afbraakenzymen die ook wel hydrolasen worden genoemd (het knippen heet hydrolyse). Toch zijn dit er relatief weinig. Er zijn namelijk 4000 enzymen die macromoleculen maken, maar slechts 60 die ze kunnen afbreken. Dit komt doordat de afbraakenzymen bepaalde groepen herkennen, maar geen specifieke moleculen. Een afbraakenzym kan dus 1 bepaalde groep van meerdere verschillende macromoleculen afbreken.

Er zijn verschillende enzymen om bijvoorbeeld eiwitten, suikers, nucleïnezuren en vetten te knippen. Deze enzymen werken optimaal bij een laag pH, van ongeveer 5. Ze zijn relatief resistent tegen afbraak, wat natuurlijk wel nodig is, omdat ze anders nooit in de lysosomen zouden kunnen bestaan. Het zijn bolvormige enzymen, waardoor ze compact zijn en dus beter resistent tegen afbraak. Verder zijn afbraakenzymen erg effectief. Chitinase bijvoorbeeld, het enzym dat chitine knipt (een stofje dat bij sommige dieren in het uitwendig skelet zit) kan 24.000 bindingen breken per seconde. Het is een bolvormig enzym met een groeve waar suikerbindende aminozuren (bijvoorbeeld chitine) en een ‘knipaminozuur’ zitten (plekje waar de knip plaatsvindt).

Je kan deze enzymen zichtbaar maken door specifieke antilichamen aan te tonen met fluor (immunofluorescentie) of met goud (immunoEM). Er is ook een nieuwe methode: een stofje dat lijkt op het substraat wat chemisch bindt in de groef en maakt zichzelf fluorescent (labeling van actief enzym). Deze methode kan je dus gewoon bij een levende cel toepassen. Je hoeft hiervoor niet eerst de cel kapot te maken (wat wel moet bij de antilichaam aantoning).

Hulpeiwitten of activatoreiwitten ‘helpen’ de lysosomen door vetten op te lossen en ze aan de lysosomen aan te bieden.

Eiwitkanalen, zogenaamde exporters, in het membraan van de lysosomen zorgen ervoor dat uitvoer van onder anderen suikereenheden en aminozuren mogelijk is.

Aan de eiwitten en vetten van het lysosomale membraan zitten aan de binnenkant veel suikergroepen verbonden. Deze groepen zorgen ervoor dat het membraan niet afgebroken wordt maar beschermd blijft. Hierdoor blijven de lysosomen dus intact. Deze beschermlaag heet glycocalyx (zit ook in ons maagdarmstelsel).

Lysosomale enzymen worden gemaakt in het ER, waar vouwing plaatsvindt. Daarna gaan ze naar het Golgi-apparaat, waar er een mannose-6-fosfaat (M6P) aan gekoppeld wordt, deze groep wordt herkend door bepaalde eiwitten. Dan kunnen de enzymen gebonden worden en uitgesorteerd naar zure ruimten, welke lysosomen zullen worden. Lysosomale enzymen hebben een laag pH optimum en werken dus pas in een zuur milieu.

Bij patiënten met de I-cell disease kan mannose-6-fosfaat niet goed aangemaakt worden. Nieuw gemaakte enzymen worden dan uitgescheiden in plaats van vervoerd naar de lysosomen. Vooral bij huidfibroblasten en neuronale cellen ontstaan hierbij grote problemen, omdat mannose-6-fosfaat voor hen essentieel is.

Alleen glucocerebrosidase (GBA) wordt niet vervoerd via het mannose-6-fosfaatpad. Ze gebruiken in plaats daarvan het Limp2-eiwit. Deficiëntie van dit eiwit leidt tot epilepsie.

LSDs zijn lysosomale stapelingsziekten. Er zijn veel niveaus waarop een fout kan zijn waardoor een LSD ontstaat. Zo kunnen er fouten zitten in het aanvoeren van enzymen naar het lysosoom (i-cell), in het enzym zelf, in membraancomponenten, in transporteiwitten enzovoort. De belangrijkste groep is defecten in de knipenzymen zelf.

De incidentie van LSDs als groep is 1:3000. 1 op de 20 personen is drager van een LSD. LSDs zijn meestal recessief. Er zijn nu 74 verschillende LSDs bekend.

De klinische manifestaties van LSDs zijn heel uiteenlopend, daarom spreek je van een heterogeen ziektebeeld. Soms zijn er zeer ernstige klachten, maar de ziekte kan ook aanwezig zijn zonder dat de patiënt er enige last van heeft.

Er zijn dus veel verschillende enzymen in lysosomen. Wanneer iemand mucopolysacharidoses heeft, doet een enzym van de suikerafbraak het niet goed.

Door het ontbreken van bepaalde lysosomale enzymen ontstaat er dus stapeling van een bepaalde stof (lichaamseigen stof). De betrokken celtypen hebben een relatieve hoge flux aan substraat bij een lage afbraakcapaciteit. De mate van restactiviteit van het enzym is afhankelijk van de mutatie. Deze restactiviteit is bepalend voor de ernst en het tijdstip van de manifestatie van de ziekte. Ook de mate van flux van het substraat in een bepaald celtype of weefsel speelt hierbij een rol. De ernst/het type van de mutatie bepaald dus de mate van stapeling.

Dragerschap voor de ziekte van Gaucher is een risicofactor voor het krijgen van Parkinson.

Hoorcollege Patiëntdemonstratie: lysosomale stapeling (1-12-14)

Patient: Tim

Als baby en klein kindje was er niks op aan te merken behalve dat hij niet luisterde, vaak een neusloop had en oorontsteking. Toen hij ongeveer 4 was, was de diagnose gesteld dat hij een stofwisselingsstoornis had. Hij had later gedragsafwijkingen. Hij was een soort grote baby. Hij is uiteindelijk op zijn 16de (ongeveer) overleden. De diagnose van Tim is Sanfilippo (niet kunnen afbreken van heparan sulfaat door het ontbreken van één enzym). Sanfilippo komt 4:100.000 voor. Heel zeldzaam dus.

Voor de ziekte van sanfilippo is er geen behandeling. Je kan alleen de pijn bestrijden.

De lysosoom is een celorganel, een soort minifabriekje. Het is betrokken bij de afbraakprocessen. Sommige cellen hebben veel meer lysosomen dan andere, cellen die veel bezig zijn met extracellulaire afbraak hebben er veel meer. Op het ER worden de enzymen gesynthetiseerd, die gaan via een transportblaasje naar het golgiapparaat waar het nog wordt aangepast. Uiteindelijk splits het van het golgiapparaat af en wordt het een lysosoom. Een lysosoom kan fuseren met een fagosoom of een endosoom en dan krijg je vertering. Maar er is ook autofagie: alle onderdelen van de cel die niet goed werken worden afgebroken . Dit gebeurd ook in staat van honger. De lysosoom heeft dus een cruciale rol in het onderhouden (gezond houden) van de cel door de regeling van intra- en intercellulair omgeving.

Je kan LSDs onderverdelen in groepen op basis van verschillende stoffen die niet worden afgebroken (dus de stof die stapelt). Bij mucopolysaccharidose kunnen GAGs niet worden afgebroken. Mucopolysccharidose is weer onder te verdelen in meerdere vormen op basis van meer specifieke stoffen die niet kunnen worden afgebroken. GAG's (glycosaminoglycanen) zitten vastgeplakt aan een eiwit. Een heleboel eiwitten in het lichaam hebben deze suikergroep. Proteoglycanen (eiwitten met GAG's) zitten vooral in het membraan. Ze hebben een belangrijke biologische functie, namelijk binden van allerlei groeifactoren. Als de GAG's stapelen dan brengt het een cascade aan problemen met zich mee. Alle biologische functies worden namelijk verstoord. Er komt ontsteking in de hersenen, neuronen gaan in apoptose waardoor het neurodegeneratieve beeld ontstaat.

Bijna alle LSDs zijn autosomaal recessief erfelijk.

LSDs:

- continue accumulatie van stapelingsmateriaal

- progressieve cellulaire en orgaanschade

- progressieve klinische achteruitgang

Qua behandeling zijn er een aantal therapeutische mogelijkheden voor een beperkt aantal van de lysosomale stapelingsziekten:

- enzym therapie (ERT)

- substraat deprivatie therapie (SDT)

- beenmergtransplantatie/navelstreng stamcel transplantatie

- gentherapie

De rede dat je het enzym wat niet werkt niet zomaar kan toedienen is dat het te moeilijk om de stof precies zo te labelen dat ze naar de goede cellen gaan en dan moeten ze ook nog het lysosoom inkomen want deze stoffen zijn alleen maar actief in een lage PH. Deze behandeling wordt wel zo goed mogelijk geprobeerd bij SDT en ERT.

Hoorcollege Lysosomale stapelings ziekten (1-12-14)

De ziekte van Gaucher kenmerkt zich door een vergrote milt en lever. Andere symptomen zijn: bot problemen, pancytopenie, hepatosplenomegalie, (neurologische afwijkingen en huidproblemen, bij ernstigere gevallen). Bij deze ziekte ontbreekt het enzym glucocerebrosidase. Dit veroorzaakt vooral het stapelen van macrofagen (een bepaald type witte bloedcellen), die dan Gaucher cellen heten (dit zijn dus lichaamseigen macrofagen, glucosylceramide-stapelende macrofagen). de gaucher cellen zitten dus op de plekken waar normaal macrofagen zitten. Vetdeeltjes stapelen zich dan op. Bij de behandeling moet geprobeerd worden zoveel mogelijk het ontstaan van Gaucher cellen te voorkomen. Als je drager bent van deze ziekte heb je 6x verhoogd risico op parkinson. Drager zijn is niet heel zeldzaam.

De ziekte is autosomaal recessief. De ziekte is aan te tonen door de enzymactiviteit te meten in het bloed of de fibroblasten. Ook kan de mutatie soms aangetoond worden als blijkt dat een bepaalde stof zich stapelt. Verder kan een mutatie aangetoond worden in de nucleotide-volgorde van een bepaald gen.

Bij milde mutaties is het enzym nog aanwezig en gedeeltelijk actief. De patiënten kunnen soms zelfs zonder klachten door het leven gaan. Bij ernstige mutaties is er geen enzymactiviteit. De patiënt heeft dan ook veel meer klachten. De mutatie bepaalt dus meestal de ernst van de ziekte.

Het missende enzym bestaat uit een vouwings- en een knippingsdomein. Een mutatie in het vouwingsdomein is vaak ernstig. Doorat het eiwit niet goed gevouwen wordt, gaat het dan niet naar het Golgi-apparaat. Bij een mutatie in het katalytische domein gaat het eiwit wel naar het Golgi-apparaat en komt wel tot expressie. Het omzetten van substraat naar product gaat alleen langzamer.

De mate van restactiviteit is dus bepalend voor de klinische manifestatie van de ziekte. Ook de flux, de aanvoer via exporters, van substraat is belangrijk.

De ernst van de manifestatie wordt ook bepaald door de mate van restactiviteit (=residuele afbraakcapaciteit) en de mate van benodigde afbraakcapaciteit (=flux van substraat)

Bij type I van Gaucher bestaat de therapie uit voorkoming van deficiëntie van glucocerebrosidase. Dit kan door beenmergtransplantatie, gentherapie enzymtherapie, substraatreductietherapie en chaperonnetherapie.

Beenmergtransplantatie wordt echter niet meer toegepast. Volledige genezing is hierbij mogelijk, maar het overlijdingspercentage is hoog. Beenmergtransplantatie wordt alleen nog uitgevoerd bij patiënten die leiden aan een ziekte waarbij geen ander alternatief is dan deze therapie.

Er is ook gedacht aan gentherapie bij de ziekte van Gaucher. Er wordt dan genetische informatie ingebracht in stamcellen. Deze cellen worden gekweekt en daarna teruggeplaatst in de patiënt. Dit zorgt echter voor een tijdelijke correctie en is niet, zoals men hoopte, een permanente oplossing. Deze vorm van therapie wordt daarom ook niet meer toegepast.

Bij enzymtherapie of ERT (enzym replacement therapie) wordt via een infuus het ontbrekende enzym toegediend. Er wordt dan eerst mannose aan het enzym gekoppeld, waardoor macrofagen ze herkennen, opnemen en transporteren naar de lysosomen. Vroeger werden de enzymen geïsoleerd uit placenta’s. Er waren dan echter erg veel placenta’s nodig om een patiënt te behandelen. Nu worden de enzymen geproduceerd. Deze therapie is effectief en is een chronische behandeling.

Bij patiënten met type II en III van de ziekte van Gaucher kan therapie de neurologische klachten helaas niet verminderen. Dit komt doordat het enzym niet door de bloed-brein barrière kan.

Beenmerg is normaal vetrijk. Bij patiënten met de ziekte van Gaucher zit er daar door stapeling minder vet. Als een behandeling werkt, ziet men vet verschijnen in het beenmerg. Dat wordt radiologisch onderzocht. Ook kan je een verklikkerstof meten om te kijken of een therapie werkt. Een hoge waarde van de verklikkerstof wijst op stapeling en duidt dus op ziekte. Bij een effectieve therapie zal de waarde van de verklikkerstof dalen.

SRT staat voor substrate reduction therapy. Bij deze vorm van therapie wordt dus de stapeling geremd. Dit wordt vooral toegepast bij patiënten met type II en III.

Ook bestaat er nog chaperonne-therapie. Hierbij wordt er een extra stofje toegevoegd waardoor de vouwing in het ER van het defecte lysosomale enzym beter gaat. Hierdoor zal meer enzym aankomen in de lysosomen.