HC5. Translatie en eiwitstructuur

Algemene informatie

• Welke onderwerpen worden behandeld in het hoorcollege?
  • In dit college wordt de translatie van DNA, de opbouw van aminozuren en de eiwitstructuur behandeld
• Welke onderwerpen worden besproken die niet worden behandeld in de literatuur?
  • Alle onderwerpen in dit college worden ook behandeld in de literatuur
• Welke recente ontwikkelingen in het vakgebied worden besproken?
  • Er worden geen recente ontwikkelingen besproken
• Welke opmerkingen worden er tijdens het college gedaan door de docent met betrekking tot het tentamen?
  • Voor het tentamen hoeven we de structuurformules van aminozuren niet te kennen
• Welke vragen worden behandeld die gesteld kunnen worden op het tentamen?
  • Wat maakt het initiator tRNA nou speciaal?
    • Het initiator tRNA is het enige tRNA dat gebonden wordt aan de lichte subunit van het ribosoom zonder dat er een lang RNA in de buurt is: het is het enige tRNA dat een affiniteit voor de subunit heeft

Transfer-RNA (tRNA)

Transcriptie is de overschrijving van DNA naar RNA. Dit gebeurt in dezelfde taal. Reverse-transcriptase kan RNA naar DNA kopiëren. De informatiestroom gaat dan de andere kant op. Translatie is de vertaling van RNA naar eiwitten. Dit gebeurt in een andere taal.

Omdat mRNA en een eiwit in een andere taal zijn geschreven, is er noodzaak voor een tolk/adapter → transfer-RNA (tRNA):

• tRNA wordt opgebouwd in een klaverbladstructuur
  • Aan de steel van de klaver zit het 3’-uiteinde
• Een stukje tRNA vormt een complex met een aminozuur
  • Aminozuren zijn covalent gekoppeld aan het 3’-uiteinde van het tRNA 
  • Dit wordt gedaan door enzymen: de aminoacyl-tRNA-synthetases: 
    • Koppelen een specifiek aminozuur aan het correcte tRNA
      • Voor elk aminozuur is er een ander aminoacyl tRNA-synthetase
    • Bij deze koppeling wordt ATP gebruikt en wordt pyrofosfaat gebruikt
      • ATP → AMP + PPi
  • De loops van tRNA bepalen welk aminozuur wordt gekoppeld → niet op het anticodon!
• De plaats waar tRNA aan mRNA bindt heet een anticodon
  • Baseparing van mRNA met tRNA gebeurt op dezelfde manier als bij DNA-replicatie (met een anticodon en codon, 5’ → 3’)
  • In tRNA komen meestal klassieke baseparingen voor, maar soms ook onconventionele (G met U)
    • Pseudo-uridinett (uracil met een C-atoom vervangen door een N-atoom) wordt niet gecodeert door DNA, maar wordt aangebracht in het tRNA

Codering in mRNA

Het gekoppelde aminozuur kan binden aan specifieke plaatsen op het mRNA: het mRNA codeert voor eiwitten in tripletten

• 1 triplet codeert voor 1 aminozuur
• Er zijn 64 mogelijke tripletten
  • 61 van de 64 coderen voor een aminozuur
  • 3 coderen niet voor aminozuur (UAA, UAG, UGA): dit zijn stopcodons

Open reading frames:

Omdat de codering in tripletten is, kan een mRNA in principe op 3 verschillende manieren vertaald worden (je kan op verschillende plaatsen beginnen met het aflezen van een triplet) → Er zijn 3 verschillende leesramen/”open reading frames”. Dit wordt opgelost door AUG: het startcodon waar de translatie begint. Hier begin je dus altijd met lezen.

• Het startcodon is dus AUG: codeert voor methionine
• Stopcodons zijn UAA, UAG en UGA: deze coderen niet voor een aminozuur → er zijn geen tRNA’s met bijpassende anticodons

Bij bacteriële mRNA’s zit het anders: het aflezen begint niet vanaf de eerste AUG op het mRNA, maar vanaf een AUG die voorafgegaan wordt door een ribosome binding site:

• Een specifieke sequentie
• De plaats waar het ribosoom landt op het mRNA → dit hoeft dus niet de eerste AUG op het mRNA te zijn

Wobble paring:

Er zijn 20 aminozuren, maar 64 codons → voor sommige aminozuren zijn er meerdere tripletten doordat tRNA’s meerdere codons kunnen binden. Dit kan door “wobble paring”:

• De baseparing tussen het anticodon en het mRNA zit iets schever, waardoor het RNA ook een wobble paring kan maken: de 3’ base aan het 5’ uiteinde van het anticodon paart met een andere base op het mRNA (G paar met U i.p.v. met C)
• Leucine kan bijvoorbeeld gecodeerd worden door CUC en CUU: beide tripletten binden aan tRNA met het anticodon GAG

Ribosomen

tRNA’s werken niet onafhankelijk werken, maar doen dit in samenhang met ribosomen: de structuur waarin eiwitsynthese plaatsvindt. Ribosomen bevinden zich in het cytoplasma. Een ribosoom is een samenstelling van eiwitten en RNA’s. De RNA’s hebben hier een structurele functie: het bijeenhouden van eiwitten van het ribosoom. Dit complex kan mRNA vertalen in een eiwit: 

• Een ribosoom bestaat uit twee delen die beide een RNA-eiwitcomplex vormen:
  • Grote subunit
    • Bestaat uit 3 verschillende RNA’s en 49 eiwitten
  • Kleine subunit
    • Bestaat uit 1 RNA en 33 eiwitten
  • Units van een prokaryoot ribosoom bevatten minder RNA’s en eiwitten
• Als er een AUG wordt gevonden op het mRNA komen de twee subunits bij elkaar
  1. Bij het vinden van een mRNA wordt eerst door de cap-site bepaald of het een mRNA is
  2. Als de cap gevonden is begint de kleine subunit het mRNA te scannen totdat het een AUG tegenkomt
  3. De kleine subunit stopt op de plaats van de eerste AUG en wacht tot de grote subunit erop landt
  4. Het ribosoom gaat verder
• Het ribosoom bevat 3 bindingsplaatsen voor tRNA’s:
  • A-plaats: hier landt het aminoacyl tRNA (tRNA dat gekoppeld is aan een aminozuur) in het complex
  • P-plaats: hier bevindt zich peptidyl tRNA (tRNA waaraan de groeiende aminozuurketen vastzit)
  • E-plaats: hier zit empty tRNA (tRNA dat geen aminozuurketen meer heeft)
    • Dit heet ook wel de exit-plaats of ejection site
• Er zijn 2 klassen ribosomen:
  • Vrij in het cytoplasma: maken eiwitten die functioneren in het cytoplasma en de kern
  • Vast aan het ER : maken eiwitten die functioneren in het ER en buiten de cel
• Er zijn korte en lange mRNA’s: omdat 1 ribosoom 20 nucleotiden bindt kunnen er meerdere ribosomen op mRNA zitten → er ontstaat een hele keten ribosomen die bezig zijn hetzelfde mRNA in eiwitten om te zetten

Polysomen:

Cytoplasmatische eiwitten worden gesynthetiseerd in poly(ribo)somen. Hierbij wordt het mRNA helemaal bedekt met ribosomen die het hele mRNA transleren en snel opgevolgd worden door een nieuw ribosoom dat hetzelfde eiwit synthetiseert → één mRNA codeert dan voor heel veel eiwitten.

De translatie

1. tRNA en een initiator-tRNA (speciaal methionine-tRNA) binden aan de lichte subunit van het ribosoom
   • In cel zijn twee tRNA’s die methionine hebben: initiator en normaal
     • Initiator-tRNA is anders dan het tRNA waar methionines midden in eiwitten worden gebonden: het moet kunnen binden aan de lichte subunit van het ribosoom zonder dat er mRNA aanwezig is
2. Het complex gaat op zoek naar mRNA
   • De voorkant van mRNA wordt herkend aan de cap-site
   • Vanaf de cap-site scant het complex het mRNA
3. Bij de eerste AUG-sequentie gaat het initiator-tRNA baseparen met het mRNA
   • Na binding van het initiator-tRNA aan het mRNA wacht de lichte subunit totdat de zware subunit aan het complex is gebonden
4. Als de zware subunit aan het complex is gebonden wordt er op de A-plaats een nieuwe tRNA met een aminozuur gebonden worden aan het initiator-tRNA
5. Na binding van een nieuw aminozuur aan methionine laat de energierijke binding tussen methionine en het initiator-tRNA los
6. De zware subunit verplaatst → het initiator-tRNA komt op de E-plaats en het tweede tRNA op de P-plaats
7. De lichte subunit verplaatst: de tRNA’s kunnen één bindingsplaats verschuiven
8. Het losgekoppelde tRNA dat op de E-plaats ligt wordt afgestoten → het proces kan opnieuw beginnen → de aminozuurketen wordt verlengd
9. Als het complex bij een stopcodon komt stopt de translatie → voor een stopcodon is geen bijbehorend tRNA
   • Het eiwit release factor voorkomt dat de reactie stopt
     • De ruimtelijke structuur lijkt heel erg op die van tRNA release factors: Ondanks het feit dat er compleet andere chemische verbindingen zijn, is de structuur hetzelfde
     • Het eiwit bevat 3 aminozuren die een baseparing vormen met het stopcodon
10. De release factor bindt op de A-plaats: doordat het geen aminozuur heeft kan het de aminozuurketen niet overnemen → de binding tussen het tRNA en de aminozuurketen wordt verbroken → eiwitten komen vrij
    • Zoogdieren hebben één release factor die alle stopcodons kunnen herkennen
    • Bacteriën hebben twee release factors: één release factor voor twee stopcodons en een andere voor het derde stopcodon 
11. De zware en lichte subunit dissociëren van het RNA, de release factor komt vrij, het laatste tRNA komt vrij → het ribosoom kan opnieuw gebruikt worden

Prokaryote versus eukaryote cellen:

Er zijn enkele verschillen tussen de translatie in prokaryotische en eukaryotische cellen:

• Co-transcriptionele translatie: in prokaryotische cellen kan de eiwitsynthese al plaatsvinden terwijl het achterstuk van het RNA nog niet gemaakt is → de transcriptie is nog bezig
  • In eukaryotische cellen is er een ruimtelijke beperking waardoor transcriptie en translatie niet tegelijkertijd kunnen plaatsvinden omdat de ribosomen zich in het cytoplasma van de cel bevinden
  • Prokaryote cellen splicen niet
• Initiatie van de translatie begint anders
• De samenstelling van ribosomen is verschillend → men kan chemische verbindingen maken die wel de eiwitsynthese van prokaryotische cellen remmen, maar niet die van eukaryotische cellen
  • Hierop is de werking van antibiotica gebaseerd

Posttranslationele eiwitmodificaties en eiwitafbraak

Om volledig te kunnen functioneren hebben eiwitten binding van een cofactor of modificaties van aminozuren nodig. Voorbeelden van modificaties zijn:

• Fosforylering
• Methylering
• Acetylering
• Covalente binding van een vetzuur
• Koppeling van twee eiwitten

Er kunnen ook aminozuren in een eiwit zitten die niet gecodeerd zijn door het mRNA → methyl-leucine en leucine worden door hetzelfde triplet gecodeerd

Eiwitafbraak:

Via ubiquitine-afhankelijke, proteasomale afbraak worden eiwitten afgebroken. Ubiquitines zijn kleine eiwtten die aan een ligase worden gebonden:

1. Ub wordt gebonden aan E1-ligase en daarna aan E2-ligase
2. E3-ligase bindt aan het substraat (het eiwit dat afgebroken moet worden)
3. Als de Ub-keten op het substraat lang genoeg is, stuurt de cel het eiwit naar een proteasoom (een kleine tube waarin het eiwit tot kleine stukjes wordt afgebroken)
4. De kleine stukjes worden verder afgebroken tot losse aminozuren
   • Deze kunnen verbrand of gerecycled worden
5. De aminozuren worden in het ER geladen met MHC-moleculen
6. De MHC-moleculen laten de peptiden buiten de cel zien
   • Zo werkt het afweersysteem

Chemische en natuurkundige eigenschappen van eiwitten

De structuur van eiwitten wordt bepaald door de opbouw van aminozuren. Elk eiwit heeft daarom dezelfde ruggengraat, het enige wat varieert zijn de zijketens. Hierdoor is de structuur per eiwit verschillend. Aminozuren worden onderling verbonden via peptidebindingen: bindingen die ontstaan doordat er water uitgescheiden wordt. De peptidebinding is een relatief starre verbinding en zorgt voor vormbehoud → eiwitketens zijn stabiel. Dit is vreemd, omdat er veel enkele bindingen in de eiwitstructuur zitten. Hierdoor zouden de ketens makkelijk om elkaar heen kunnen draaien. Dit wordt opgelost door het ontstaan van een resonantiestructuur: een dubbele binding wordt gedeeld met een enkele binding → er is geen rotatie mogelijk. Dit is te vinden bij elke peptidebinding.

De eiwitsynthese vindt plaats van de amine-terminus naar de carboxyterminus → de aminozuurvolgorde wordt altijd van N-term (NH2) naar C-term (COOH) weergegeven. De structuur van eiwitten bepalen hun functie:

• Primaire structuur: de aminozuurvolgorde
  • Positief geladen: arginine, lysine, histidine
  • Negatief geladen: aspartinezuur, glutaminezuur
    • Het is belangrijk te weten welke zijketen negatief en welke zijketen positief geladen is
  • Voor een zwavelbrug is een cysteïne nodig
  • Methionine is het begin van ieder eiwit
  • Serine, threonine en tyrosine hebben een hydroxylgroep (OH-groep) in de zijketen die vervangen kan worden door een fosfaatgroep → sterk negatief geladen → effect op de eiwitstructuur
    • Phosphoserine
    • Phosphothreonine
    • Phosphotyrosine 
  • Sommige aminozuren zijn hydrofiel, andere hydrofoob
  • Essentiële aminozuren: kan het lichaam niet zelf maken
  • Semi-essentiële aminozuren: moeten in bepaalde situaties via de voeding opgenomen worden
  • Niet-essentiële aminozuren: kan het lichaam zelf produceren
  • Pre-peptiden: de eerste aminozuren in de keten, worden als het eiwit wordt uitgescheiden door de cel afgeknipt
  • Pro-peptiden: peptide met C-peptide
    • Het C-peptide moet er af voordat de A- en B-ketens aan elkaar kunnen koppelen
• Secundaire structuur: het geheel aan alfa-helices en bèta-sheets
  • Alfa-helixes worden gevormd door waterstofbruggen tussen de moleculen → vormt een helix
    • Deze waterstofbruggen worden gevormd door atomen van de backbone, niet van de zijgroepen!
  • Bèta-sheets zijn waterstofbruggen van delen van het eiwit die verder uit elkaar zitten
    • Parallelle bèta-sheets
    • Anti-parallelle bèta sheets
    • Deze waterstofbruggen zitten niet binnen de ketens, maar ertussen
    • Zijde bestaat uit bèta-sheets van alanines en glycines
  • Niet elk eiwit heeft deze structuur: zijgroepen van de aminozuren kunnen deze structuren verbreken
• Tertiaire structuur: de ruimtelijke structuur van één eiwitketen (kristal of 3D)
  • Hierbij zit een heemgroep: de plaats waar zuurstof gebonden kan worden
  • Elk eiwit heeft een tertiaire structuur
• Quaternaire structuur: de ruimtelijke structuur van een complex van meerdere eiwitketens samen
  • Omdat het eiwit myoglobine uit één aminozuurketen bestaat, heeft het geen quaternaire structuur

Belangrijke verbindingen:

De onderstaande verbindingen zorgen ervoor dat een eiwit zijn structuur krijgt:

• H-bruggen: waterstofbruggen tussen polaire groepen binnen de keten
• Vanderwaalsbindingen: hydrofobe CH3-groepen trekken naar elkaar toe
• Elektrostatische aantrekkingen: geladen groepen trekken naar elkaar toe
• Zwavelbruggen: stabiliseren de eiwitstructuren
  • Treden tussen cysteïnes op
  • Kunnen binnen en tussen de ketens optreden
  • Worden buiten de cel gevormd

Bekende eiwitketens:

• Hemoglobine: een eiwitcomplex dat bestaat uit 4 eiwitketens, 4 heemgroepen en dus 4 bindingsplekken voor zuurstof
  • Als één van deze plekken is gebonden aan zuurstof, vervormen de andere plekken zodat ze eerder zuurstof kunnen opnemen: coöperatieve zuurstofbinding
  • Als de binding met zuurstof verbroken wordt, nemen de meeste eiwitten weer dezelfde vorm aan: denaturatie
    • Dit gebeurt met ureum
• Keratine: heeft alfa-helices en bevat veel cysteïne en dus veel zwavelbruggen
  • Als er een permanent in het haar wordt gezet, worden de zwavelbruggen verbroken
• Collageen: bestaat uit 3 eiwitketens die als een omgedraaide alfa-helix om elkaar heen zijn gewikkeld 
  • Bevat gemodificeerde aminozuren
    • 4-hydroxyproline
    • 3-hydroxyproline
    • 5-hydroxylysine
    • Ontstaan uit proline → staan niet in de aminozurentabel omdat ze gemodificeerd worden wanneer ze al in de cel zitten
      • Voorbeelden van posttranslationele modificaties: vinden plaats nadat het eiwit al gesynthetiseerd is
• Insuline: moet uitgescheiden worden door de cel
  • Bestaat uit pre-, pro- en normaal insuline