HC4. Nucleïnezuren en eiwitten

Algemene informatie

• Welke onderwerpen worden behandeld in het hoorcollege?
  • In dit college wordt de DNA-replicatie behandeld
• Welke onderwerpen worden besproken die niet worden behandeld in de literatuur?
  • Alle onderwerpen in dit college worden ook behandeld in de literatuur
• Welke recente ontwikkelingen in het vakgebied worden besproken?
  • Er worden geen recente ontwikkelingen besproken
• Welke opmerkingen worden er tijdens het college gedaan door de docent met betrekking tot het tentamen?
  • Er zijn geen opmerkingen gemaakt over het tentamen
• Welke vragen worden behandeld die gesteld kunnen worden op het tentamen?
  • Er zijn geen potentiële tentamenvragen besproken

Het centrale dogma van de moleculaire biologie

DNA repliceert zich op het moment dat celdeling plaatsvindt → aan elke dochtercel wordt hetzelfde DNA doorgegeven. DNA heeft pas impact als het tot expressie komt.

DNA bevat een code die kan leiden tot mRNA, dat codeert voor eiwitten:

• De overschrijving van DNA naar RNA heet transcriptie
  • RNA is uit hetzelfde materiaal opgebouwd als DNA: nucleotiden
• De stap van RNA naar eiwitten heet translatie
  • Eiwitten zijn van een hele andere structuur dan RNA: aminozuren

De bouwstenen van DNA:

DNA en RNA zijn opgebouwd uit nucleotiden:

• Suikermolecuul 
  • Ribose wordt gebruikt in RNA
  • Des-oxyribose wordt gebruikt in DNA
• Fosfaatgroepen
• Bases:
  • DNA: adenine, thymine, guanine, cytosine
  • RNA: adenine, uracil, guanine, cytosine

Bouwstenen van DNA zijn deoxy-ribonucleotides, hier zijn 4 soorten van:

• dAMP
• dTMP
• dGMP
• dCMP

De bases zijn van belang om een dubbele helix te kunnen vormen. Adenine vormt een waterstofbrug met het tegenoverliggende thymine (of uracil), cytosine met guanine. Een DNA-streng krijgt een backbone doordat de fosfaatgroepen verbonden zijn aan de suikergroep van de voorganger. Hierdoor ontstaat de 5’ → 3’  binding:

• DNA heeft een strengrichting met een 5’ (fosfaatgroep) begin en een 3’ (OH groep) uiteinde
• De 2 DNA-strengen moeten antiparallel aan elkaar zijn om baseparing te laten plaatsvinden

DNA-replicatie

Met DNA-replicatie wordt het kopiëren van DNA bedoeld. Om celdeling te laten plaatsvinden moet DNA verdubbeld zijn.

Gegevens over DNA-replicatie:

• DNA-replicatie is semi-conservatief: 
  1. De dubbele helix (die bestaat uit twee DNA-strengen) wordt in tweeën gesplitst
  2. De ene streng vormt de template voor een nieuwe streng van het ene DNA-molecuul, de andere streng voor het andere DNA-molecuul
• DNA-synthese verloopt altijd in de 5’ → 3’ richting
  1. Aan de template streng moeten nieuwe nucleotiden gemaakt worden → hiervoor zorgt DNA-polymerase: vormt een 3’ → 5’ binding
  2. De nieuwe nucleotide (een trifosfaat) komt eraan → brengt zijn eigen energie mee om de polymerisatie te laten verlopen 
     • 2 fosfaten worden van de nucleotide afgeknipt → energie komt vrij en zorgt ervoor dat het 3^e fosfaat een verbinding vormt met de OH-groep (base) van de vorige nucleotide
• DNA-replicatie is zeer nauwkeurig, er zijn anders te veel mutaties → er is slechts 1 fout per 10⁷ baseparen
  • Dit omdat DNA-polymerase heel zelden een andere nucleotide inbouwt
  • Als dit wel gebeurt worden replicatiefouten onmiddellijk verwijderd door “proofreading” van de activiteit:
    • DNA-polymerase voelt dat er iets niet klopt → verwijdert de laatste ingebouwde nucleotide
    • Dit heet ook wel 3’ → 5’ exonuclease
  • Door “mismatch repair” kunnen replicatiefouten ontsnapt aan de “proofreading” alsnog hersteld worden

Replicatie in zijn werking:

1. DNA-replicatie begint bij “origins of replication”: specifieke regio’s in het DNA waarvan een eiwit weet dat daar de helix geopend kan worden om DNA-polymerase de ruimte te geven om een nieuwe streng in te bouwen
   • Het mensengenoom heeft 30.000 tot 35.000 “origins of replication”
   • Deze regio’s zijn vaak rijk aan adenine en thymine → de A-T baseparing is minder sterk omdat hiertussen maar 2 waterstofbruggen zitten
2. De splitsing van de 2 DNA-strengen wordt gedaan door initiatoreiwitten:
   • Herkennen het A-T rijke gebied → trekken de strengen uit elkaar
3. Als de strengen uit elkaar zijn getrokken bindt het enzym helicase op het DNA → despiraliseert en splitst
   • Replicatie induceert rotatiespanning in de helix → hierdoor wordt de winding van het dubbelstrengs DNA vóór de replicatievork steeds strakker: “supercoiling”
     • Het enzym topo-isomerase zorgt ervoor dat de windingen worden opgeheven: breekt enkele DNA-strengen op → haalt een lus eruit → plakt ze weer aan elkaar
       • Topoisomerase heeft een endonuclease-activiteit en een plakactiviteit
4. Het ringvormige eiwit sliding clamp bevindt zich rondom het DNA en zorgt ervoor dat het DNA-polymerase vast blijft zitten
5. Vanuit de “origin of replication” gaat de replicatie beide kanten op → in de cel ontstaan “replicatiebubbels” gerepliceerd DNA
   • In één bubbel zijn dus twee replicatievorken die elk een andere kant op gaan
   • Uiteindelijk is er wel volledige replicatie van het genoom
6. Single strand DNA-binding proteins binden in de replicatiebubbel op het enkelstrengs DNA → voorkomt dat het niet opnieuw basenparen vormt en beschermt het tegen nucleases
7. Doordat DNA-synthese alleen in de 5’ → 3’ richting kan plaatsvinden ontstaat er een leading strand en een lagging strand
   • • Leading strand synthese is continu
     • Lagging strand synthese gebeurt in stukjes: okazaki-fragmenten
8. Om replicatie van de lagging strand te laten plaatsvinden heeft DNA-polymerase een 3’-OH groep nodig om aan te binden
   • Het eiwit primase synthetiseert een RNA-primer → deze kan uit het niets een paar nucleotiden maken die complementair zijn aan het DNA
     • De synthese van RNA-primers heeft een interval van ongeveer 200 nucleotides
   • DNA-polymerase synthetiseert DNA tot de eerdere RNA-primer
   • Als het volgende okazaki-fragment aankomt bij de RNA-primer van het vorige stukje verwijdert nuclease de RNA-primer
   • DNA-repair-polymerase vult de lege plek waar de RNA-primer op zat
   • Ligase verbindt de 2 okazaki-fragmenten
     • Ligase is een eiwit dat dat de 3’ OH-groep van het ene fragment aan de 5’ fosfaatgroep van het andere fragment plakt → hiervoor is ATP nodig
   • Resultaat: een dichtgebreid stuk DNA uit de lagging strand

Overzicht betrokken enzymen:

Het einde van een chromosoom:
Chromosomen zijn lineair: ze hebben een uiteinde. Telomeren zijn de uiteinden van DNA. Primase kan in de buurt van het uiteinde wel een primer maken, maar de kans is zeer klein dat dit precies bij het einde gebeurt. Op het moment dat nuclease zou komen, ontstaat er een gaatje dat niet meer dichtgemaakt kan worden omdat het niet in de 5’ → 3’ richting gaat. Als de telomeren dus net als de rest van de DNA-streng opgebouwd zouden zijn, zouden bij replicatie de telomeren steeds korter worden. Dit wordt opgelost door verdubbeling van de telomeerfrequenties. Het enzym telomerase maakt repeat sequences → telomeren bestaan uit steeds hetzelfde stukje DNA:

• In de meeste cellen worden telomeren steeds korter, omdat telomeren niet altijd tot expressie komen
• Bij kanker komt telomerase voortdurend tot expressie om celdeling mogelijk te blijven maken

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Replicatie kan in het lab nagemaakt worden door het opwekken van een PCR. Hierbij worden korte fragmenten gesynthetiseerd:

1. Een stukje duplex DNA wordt uit elkaar gehaald door verhitting tot 95 graden
2. Er worden stukjes artificieel DNA (primers) toegevoegd voor de delen van het DNA die gerepliceerd moeten worden
3. Hittebestendige DNA-polymerase en nucleotides worden toegevoegd
   • Taq-polymerase is polymerase van de bacterie Thermus aquaticus, deze leeft in hittebronnen op IJsland
4. Dit proces wordt herhaald → hoe meer cycli, hoe meer stukjes van hetzelfde DNA
   • Er is een exponentiële toename: na 20 cycli zijn er 10⁶ moleculen

Toepassingen:

PCR kan op veel gebieden gebruikt worden:

• Forensisch onderzoek (DNA-fingerprinting)
  • Iedereen heeft kleine stukjes DNA in ons genoom geïncorporeerd: short tandem repeats
    • Deze verschillen per individu van lengte → voor iedereen uniek
  • Er worden primers toegevoegd die hybridiseren met het DNA vlak naast de STR’s → hiermee kan de lengte van de STR’s geïndentificeerd worden: individuen kunnen uit elkaar gehaald worden
• Prenatale diagnostiek
• Gevoelige detectie van pathogenen
• Biomedisch onderzoek

Transcriptie

DNA versus RNA:

DNA dient als template om RNA te maken. Messenger RNA (mRNA) codeert voor eiwitten. Doordat eiwitten niet direct uit DNA worden opgebouwd, is er flexibiliteit voor de hoeveelheid eiwitten die geproduceerd wordt.

Er zijn enkele verschillen tussen DNA en RNA:

• RNA bestaat uit ribose en heeft een extra OH groep op elke 2^e C-atoom
• DNA gebruikt de base thymine en RNA gebruikt uracil

RNA gebruikt DNA als template (matrijsstreng). Het RNA-molecuul is dus complementair aan deze streng.

Transcriptie in prokaryoten:

RNA-polymerase maakt ketens door in de 5’ → 3’ richting een RNA-molecuul te maken. RNA-polymerase bevat een sigmafactor: deze bindt heel specifiek aan een bepaalde sequentie in het DNA. RNA-polymerase kan een bepaalde helix uit elkaar halen en kan de RNA-vorming starten. Bij prokaryoten vertellen specifieke DNA-volgordes waar de transcriptie gestart en beëindigd moet worden:

• De transcriptie start bij de promotor
• De transcriptie eindigt bij de terminator

Transcriptie in eukaryoten:

Transcriptie in eukaryoten is ingewikkelder omdat DNA verpakt zit in chromatine.

• 1. RNA-polymerase-II kan door binding van algemene transcriptiefactoren de transcriptie op het DNA beginnen
     • Binden aan TATA-binding proteïnen
     • TFIIB bindt aan TFIID → TFIIE en TFIIH komen vrij
       • TFIIH heeft een helicase
     • Een TFII fosforyleert RNA-polymerase → de RNA-synthese start
  2. Nieuw gesynthetiseerd RNA is pre-mRNA: het moet nog “mature” mRNA worden → dit vindt plaats in 3 processen die gereguleerd worden door het binden van eiwitten 
• 5’ capping: het aanbrengen van een speciale nucleotide aan de 5’-fosfaatgroep met daartussen een trifosfaatbrug
  • Draagt bij aan de stabiliteit van het mRNA en is van belang voor de herkenning van mRNA door ribosomen voor de translatie
    • Beschermt het mRNA tegen nucleases
  • De eerste 5’ capping vindt plaats nadat ongeveer 30 nucleotiden van het RNA zijn gevormd
• Splicing: het verwijderen van de niet-coderende gedeeltes (intronen) in het RNA
  • Intronen zijn stukjes DNA die niet coderen voor eiwit
  • Exonen coderen wel voor een eiwit
  • Alternatieve splicing is het uitknippen van steeds verschillende delen uit het pre-mRNA → er ontstaan mRNA’s voor verschillende eiwitten
  • Wordt uitgevoerd door eiwit-complexen (snRNPs: small nuclear ribonucleoproteins)die specifieke sequenties herkennen en intron-exon boundaries aan elkaar zetten
    • Zo’n specifieke sequentie moet ook aan het uiteinde zitten om herkend te worden
    • Specifieke sequentie: vrijwel altijd een AG in het ene deel gevolgd door een G in het andere deel
    • Dit gebeurt in 5’ → 3’ richting
• 3’-polyadenylering: aan het einde van een RNA-molecuul wordt een lange poly-a staart gezet
  • Een poly(A)-staart is een lange staart van 150-250 adenines
  • Op het pre-mRNA ligt het poly(A)-signaal (AUAAAtt) dat door het poly(A)complex herkend wordt → knipt 30 nucleotiden van het pre-mRNA → het enzym poly(A)-polymerase plakt de poly(A)-staart aan het 3’ einde van het pre-mRNA
  • Dit is van belang voor de stabiliteit en bescherming tegen nucleases: om bij het coderende RNA te komen moet eerst de poly(A)-staart doorbroken worden

Als mRNA helemaal is afgemaakt kan het door eiwitten herkend worden en wordt het naar het cytoplasma getransporteerd worden. Hiervoor zijn 3 eiwitten nodig:

• Het cap-binding proteïne bindt na 5’ capping aan de “cap” op het mRNA
  • In het cytoplasma wordt het cap-binding protein verwijderd: initiatiefactors voor translatie kunnen aan de cap binden
• Een “exon junction complex” die na splicing gevormd wordt
• Een poly(A)-binding proteïne die na polyadenylering aan de poly(A)-staart bindt

Deze eiwitten functioneren als controlemechanisme voor het mRNA → als er iets niet klopt in het mRNA, wordt het in de kern gelijk afgebroken.

Regulatie van transcriptie:

De transcriptie wordt op meerdere manieren gereguleerd:

• DNA bindt met activatoreiwitten die de vorming van het basale RNA Pol-II transcriptiecomplex versnellen
  1. Activatoreiwitten (transcriptieactivatoren) binden aan DNA
  2. Maken loops in het DNA waarmee ze andere factoren naar het basale RNA Pol-II transcriptiecomplex brengen → versnellen de opbouw van dit complex
     • Zonder versnellen verloopt de transcriptie heet langzaam → er wordt onvoldoende RNA gesynthetiseerd
  • Regulatie is dus gebaseerd op hoe snel het transcriptieproces plaatsvindt
• Chromatine “remodeling” complexes: DNA-modificatie en histonmodificatie spelen ook een rol in de regulatie van de transcriptie →maken de winding van DNA om de histonen wat losser → er komt ruimte in het transcriptiecomplex
  • Histon-modifying enzymes veranderen de structuur van histonen → worden minder strak opgevouwen
    • Binden aan het DNA en zorgen voor bepaalde modificaties van de histonen
    • De staart van histon 3 bevat veel arginines, lysines en serines: deze hebben chemische groepen die gemodificeerd kunnen worden:
      • Serine heeft een hydroxylgroep die gefosforyleerd kan worden
      • Lysine heeft een groep die gemethyleerd kan worden
      • Arginine heeft een groep die geacetyleerd kan worden
      • Een histoncomplex bestaat uit histon 2A, 2B, 3 en 4 die elk een staart hebben: histon-modifying enzymes veranderen het histon vooral bij de staart → dit deel steekt uit en is daarom toegankelijk voor de enzymen
    • Epigenetische overerving: na replicatie wordt een histonmodificatiepatroon doorgegeven aan de dochtercellen
      • Na replicatie heeft slechts de helft van de dochternucleosomen de gemodificeerde histonen: het histonenmodificatiepatroon van de moeder moet opnieuw worden geconstrueerd door eiwitten die de modificaties herkennen → deze kunnen ze zelf katalyseren
• DNA-modificatie: cytosine wordt gemethyleerd
  • Na de celdeling wordt het methyleringspatroon doorgegeven aan de dochtercellen
  • DNA-methylering correleert met transcriptieremming
• Een mediator is een groot eiwitcomplex dat zowel bindt aan de algemene transcriptiefactoren als een RNA pol-II → het is een co-activator voor het transcriptie eiwit